細胞污染的類型

是不是細胞污染？是哪種細胞污染？如何識別？

細胞中如果污染**，*常見的有枯草桿菌等革蘭陽性菌以及大腸桿菌、假單孢菌等革蘭陰性菌，其中又以白色葡萄球菌較常見。培養細胞受**污染后，會很快出現培養液變混濁，pH 改變。

也有少數培養液肉眼觀察無多少改變，只能在鏡下發現菌體才知污染。所以，每天應仔細觀察。污染后細胞發生病理改變，胞內顆粒增多、增粗，*后變圓脫落死亡，造成實驗失敗和細胞株(系)丟失。

**在普通倒置顯微鏡下為黑色細沙狀，根據感染**的不同，可有不同的外形，培養液一般會渾濁變黃，對細胞生長影響明顯。

如何預防

• 仔細檢查一下器皿的**情況，是否在高壓**時放氣時間足夠、壓力足夠。

• 重點檢查和儲存培養液接觸的移液管等物品，連續兩次污染的話有可能造成儲存液污染，一定要注意。

• 下次使用前檢查一下培養液是否存在渾濁的現象，可在培養液中加相應的***處理。

霉菌污染以后，培養液是清亮的，倒置顯微鏡下無雜質，37 度孵箱培養 2-3 天，仍清亮，但出現絮狀雜質。鏡下可見呈細絲狀的團狀漂浮物，可看到明顯的菌絲，細胞仍可生長，但時間長之后，細胞的活力狀態變差。

用硫酸銅溶液擦拭 CO2 孵箱內，再把水盤里也加上飽和量的硫酸銅。或者在培養箱的托盤加入飽和的**磷酸氫二鈉高鹽液體, 可以防止霉菌污染。

CO2 孵箱被霉菌污染后，可把所有細胞暫時轉移，采用過氧乙酸擦洗孵箱（包括隔板，箱壁）。并把過氧乙酸放置在孵箱內一個小時，使其蒸汽彌漫。待過氧乙酸的氣味消散后，再移入細胞。孵箱應定期清潔（2 月左右），尤其在多雨的季節。

其它培養箱清洗方法是：用 84 液擦洗－清水擦洗－75% 酒精擦洗－紫外燈照。

如何預防

• 可在培養基里加 3u/mL 的兩性霉素或制霉菌素或放線菌素 D 或雙抗。

• 細胞一旦污染，很難挽救，制霉菌素或放線菌素 D 或雙抗都于事無補，建議舍棄該污染細胞。

• 將環境徹底**，如果所有細胞都污染，可能是系統污染，檢查一下培養基和器材，如果只是個別污染，可能是操作問題，就要注意操作。

上圖是典型的霉菌污染，肉眼看到白色的團塊或白點，鏡下呈絲狀。400 倍圖片如上。

支原體感染細胞以后，細胞病變不很明顯，只是慢慢死去。培養液一般會渾濁。

國內血清很多都沒有做支原體陰性檢測，而支原體是牛血清中*常見的微生物之一。而且它不能用過濾的辦法除去。可用泰樂菌素——獸用支原體病的藥，無任何**反應。如果用的是 Sigma 公司的，使用時用 50u g/mL Tylosin 培養液培養 6 天或連續傳兩代即可**支原體污染。如果作為常用的***的話, 建議用 8 ug/mL

一般培養液清亮，不變色，鏡下有絲狀物，有些**開始很像死細胞碎片，只是它很多很多的小塊很清楚，象珊瑚狀，不象細胞碎片分不清，慢慢的會長出很細的黑色絲狀物。

**生長的比較慢，不象**那么容易被發現，但是一旦發現有它的存在細胞就被污染了，也很難救活了。

培養液可輕微渾濁，顯微鏡下那些細小的點狀物數量非常多，輕微活動，細胞雖然可以生長但繁殖速度卻明顯減慢，而且細胞狀態不好，邊緣不清楚，細胞不透亮。他們與細胞可共生但會與細胞爭奪營養。這種共生是非常普遍的，但他們的數量小，細胞占優勢所以不會影響到細胞的正常生長，只有當他們到達一定的數量時就會影響到細胞的生長，*終形成惡性循環。

污染的可能原因：配液**問題、操作問題、環境問題等等。

關于培養基的無菌狀況，取培養基至培養瓶中（不加細胞），37 度試培養一段時間后觀察。如果沒有**生長 就是操作的問題。也可以在培養基中事先加入雙抗（硫酸鏈霉素和氨芐青霉素）。但雙抗有時會影響細胞的狀態，所以在做轉染、檢測細胞某項指標前一定要撤去雙抗，以避免影響實驗結果。

如何預防

• 孵箱應定期用三氧機**或者紫外光照射，并用酒精和新潔爾滅試擦孵箱，同時孵箱內的水應是三蒸水。

• 超凈臺、取材、器材、培養液、培養瓶、操作等因素

• 超凈臺的風機不能過大，風機到 6-8 格。否則也可能能致霉菌污染。

• 無菌室經甲醛熏蒸**后，可用同等量的氨水噴灑中和，約幾小時即可進入操作。